Ocena KIR4.1 jako cel immunologiczny w stwardnieniu rozsianym

Poszukiwanie specyficznych autoprzeciwciał u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym było obszarem intensywnych badań od dziesięcioleci, ale jednoznaczna identyfikacja jednego lub kilku autoantygenów związanych z chorobą pozostaje nieuchwytna. Jednak duże zainteresowanie wzbudziło badanie wykazujące obecność autoprzeciwciał w surowicy w KIR4.1, kanale potasowym prostowniczym, prostującym wewnętrznie, u 47% dorosłych pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, ale nie u pacjentów z innymi chorobami neurologicznymi lub u osób zdrowych. .1 Jednak kolejne niezależne badania, które przeprowadzono przy użyciu testu opartego na komórkach lub testu immunoenzymosorpcji opartego na antygenie peptydowym (ELISA), nie potwierdziły tych wyników.2-4 W związku z tym obecność autoprzeciwciał KIR4.1 u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym pozostaje kontrowersyjna. Powszechność wśród badań, które były sprzeczne z oryginalnym raportem, jest to, że nie zastosowano jednego z trzech podejść, które pierwotnie były stosowane do pomiaru autoprzeciwciał, ELISA opartego na antygenach białkowych. Ta procedura ELISA obejmuje ekspresję in vitro i oczyszczanie białka KIR4.1 o pełnej długości, pozwalając na jego natywny zestaw tetrameryczny i izolację izoform o niskim glikozylowanym KIR4.1, z których oba są krytyczne dla wiązania autoprzeciwciał.5 W związku z tym staraliśmy się niezależnie potwierdzić obecność tych autoprzeciwciał przy użyciu tego podejścia. Ryc. 1. Ryc. 1. Wykrywanie białka KIR4.1 w próbkach od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i kontrolą. Wyniki testu Aelel A pokazują wyniki testu immunoenzymatycznego (ELISA) opartego na białku, stosowanego do wykrywania autoprzeciwciał przeciw KIR4. w próbkach uzyskanych od 86 pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (MS) i 51 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Próbki MS obejmowały surowicę od 68 pacjentów z chorobą rzutowo-remisyjną, 8 z wtórną chorobą po stępującą, 4 z pierwotną chorobą postępującą i 6 z klinicznie izolowanym zespołem. Oczyszczone tetramery KIR4.1 zostały kowalencyjnie związane z płytkami. Średnia gęstość optyczna (? SD) w testach wynosiła 0,4844 ? 0,5217 w grupie MS i 0,5799 ? 0,8107 w grupie kontrolnej (P> 0,05 dla wszystkich porównań). Każda próbka surowicy została przetestowana w dwóch powtórzeniach. Reaktywność dodatnią (linia przerywana) zdefiniowano jako 5 SD powyżej średniej gęstości optycznej grupy kontrolnej. Elucję (E1) i elucję 3 (E3) uzyskano przez zastosowanie wzrastających stężeń imidazolu i wzbogacono odpowiednio w tetramery KIR4.1 o wysokim i niskim glikozylowaniu. W związku z tym E1 wykorzystano do pomiaru niespecyficznego wiązania, a E3, który zawiera immunoreaktywną frakcję KIR4.1, zastosowano do pomiaru specyficznych autoprzeciwciał. Gęstość optyczną zmierzono dzieląc różnicę między E1 i E3 przez E1. Panel B pokazuje wyniki testu ELISA w celu o ceny wzbogacenia niskich glikozylowanych tetramerów KIR4.1 w wyeluowanych frakcjach KIR4.1 znakowanych histydyną z kolumny chelatującej kobalt. Dwie studzienki każdej płytki, które użyto do wytworzenia danych w Panelu A inkubowano z monoklonalnym przeciwciałem 20F9, które specyficznie wiąże się z tetramerami KIR4.1 w ich stanie niskiej glikozylacji. Średnia gęstość optyczna wynosiła 0,4620 ? 0,2648 dla E1 i 2,114 ? 0,08838 dla E3 (P = 0,002). Każdy punkt danych reprezentuje wartość uzyskaną w pojedynczym odwiercie. Gęstości optyczne w panelach A i B skorygowano dla tła, odejmując wartość otrzymaną przy 540 nm od tej otrzymanej przy 450 nm. Paski I w panelach A i B oznaczają SD. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą testu U Manna-Whitneya. W tym celu przeprowadziliśmy test, stosując szczegółowe instrukcje dostarczone przez autorów oryginalnego raportu podczas wizyty w ich laboratorium w ramach współpracy wymiany naukowej. Ponadto, zastoso waliśmy monoklonalne przeciwciało (20F9), które jest specyficzne dla tetramerycznych i niskiej glikolizowanych izoform KIR4.1, dla potwierdzenia wzbogacenia postaci antygenowej. Przetestowaliśmy surowicę uzyskaną od 86 pacjentów na kliniki ze stwardnieniem rozsianym i 51 zdrowych dawców kontrolnych w naszym ośrodku. Żadna z próbek z grupy stwardnienia rozsianego ani grupy kontrolnej nie wykazywała reaktywności KIR4.1 i nie ustalono znaczącej różnicy między grupami (P> 0,05) (Figura 1A). Wzbogacenie izoformy tetrameru o niskim glikozylowanym KIR4.1 potwierdzono monoklonalnym przeciwciałem 20F9 (P = 0,002) (Figura 1B). Podsumowując, wyniki te wskazują, że autoprzeciwciała przeciwko KIR4.1 mogą nie być swoiste dla stwardnienia rozsianego. Dalsze poparcie dla tego punktu widzenia znajduje się w tym wydaniu czasopisma Pröbstel i wsp., Który zastosował podejścia, które były podobne do naszych i które dały podobne wyniki.6 Jednak nasze doświadczenia z tes tem ELISA ujawniły znaczne wyzwania metodologiczne i wymagały, aby są nieodłączne od testu – w szczególności te związane z modyfikacjami potranslacyjnymi i formowaniem struktury wyższego rzęd [więcej w: leczenie endometriozy, leczenie endometriozy forum, Usługi stomatologiczne ]

[więcej w: lacibios femina żel, przepisy na zdrowe śniadanie, drenaż limfatyczny poznań ]